Il cambiamento dimensionale (Italian Edition)
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Rispetto ad altri metodi in vitro , queste culture meglio rappresentano modelli di tumore in vivo e osservazioni cliniche 3. Negli ultimi anni, molti studi si sono concentrati sull'influenza dell'ambiente di matrice tumorale in GBM 6 , 7 , 8. Molti studi hanno riferito HA sovraespressione in tumori GBM e suoi effetti successivi il cancro progressione 8 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 , Ad esempio, fibronectina e vitronectina, che in genere sono iperespressi in GBM, indurre eterodimerizzazione di recettori di superficie delle integrine tramite l'associazione alla sequenza "RGD" e avviare complesse cascate di segnalazione che favoriscono la sopravvivenza del tumore 19 , 20 , Farmaci promettenti risultati in modelli 2D o gliomasphere hanno fallito in successivi studi sugli animali e casi clinici 3 , che indica che gli effetti di fattori microambientali contribuito notevolmente al GBM tumore risposta 1.
A differenza dei modelli precedentemente segnalati biomateriale del GBM microambiente tumorale 26 , 27 , che non hanno raggiunto un vero controllo ortogonale su singole caratteristiche biochimiche e fisiche della ECM, la piattaforma di biomateriale qui segnalati consente il disaccoppiamento dei contributi delle diverse funzioni indipendenti per fenotipo delle cellule GBM.
Qui, presentiamo un sistema basato su HA, ortogonalmente sintonizzabile, idrogel per 3D cultura di cellule GBM derivanti dal paziente. Idrogeli sono formati da due componenti del polimero: HA 1 biologicamente attivo e 2 biologicamente inerte polietilenglicole PEG. Inoltre, stechiometrici controlli possono essere utilizzati per coniugato peptidi cisteina-terminato a un numero definito di medio di terminazione maleimide braccia su ogni 4-braccio-PEG.
Incorporazione di peptidi ECM-derivato, adesivi consente interazioni con le integrine su cellule in coltura, attraverso il quale segnali biochimici e chimici sono trasdotte 1. Aggiunta di maleimide-tiolo si verifica molto rapidamente in condizioni fisiologiche, riducendo al minimo il tempo necessario per incapsulamento cella e massimizzare sopravvivenza delle cellule derivate dal paziente.
Inoltre, idrogel culture possono essere trattate come esemplare tipico del tessuto e sono compatibili con tecniche di caratterizzazione standard tra cui il Western blotting, citometria a flusso e immunofluorescenza. Il seguente protocollo descrive le procedure per la realizzazione di idrogeli, instaurazione 3D delle colture di cellule GBM derivate da paziente e tecniche per l'analisi biochimica. Please recommend JoVE to your librarian.
Tutti i tessuti umani raccolta punti sono stati effettuati sotto protocolli istituzionalmente approvati. Rapporti molari sono indicati rispetto al numero totale di gruppi carbossilato, se non diversamente specificato. Qui, descriviamo un protocollo utilizzando uno spot kit vedere la tabella materiali per estrarre RNA totale dalle cellule coltivate di idrogel. I buffer e tutto il materiale sono disponibili all'interno del kit utilizzato. Usando la formazione immagine di bioluminescenza, che viene comunemente utilizzata per monitorare i tumori xenotrapiantati roditore, numeri relativi delle cellule vitali possono essere osservati in idrogel culture durante il corso del trattamento.
Figura 3B fornisce un esempio di questo metodo, dove gli effetti del trattamento di erlotinib sulle cellule GBM idrogel-coltivati sono stati valutati in 6 giorni.
In generale, idrogel culture possono essere trattate come campioni di tessuto durante la preparazione lisati per Western blot o PCR. Allo stesso modo, sospensioni di cellule singole possono essere preparate da culture di idrogel per l'analisi tramite citofluorimetria usando protocolli standard per la liberazione di singole cellule da tessuti intatti Figura 2.
Oltre alle caratteristiche delle cellule, cryosections delle culture basate su idrogel, 3D preservare ECM depositati dalle cellule coltivate.
Il Cambiamento Dimensionale, Nostro E del Pianeta Terra (Italian, Electronic book text)
Ad esempio, modelli di deposizione dello spostamento del collagene di tipo IV previo trattamento di erlotinib di idrogel culture Figura 3D. Rappresentante H 1 -RMN spettro dell'acido ialuronico chitosani. Proliferazione delle cellule di idrogel-incapsulato. Dopo reticolazione, idrogeli sono stati gonfiati in mezzo di coltura cellulare. B risultati rappresentativi del tasso di proliferazione misurata mediante citometria a flusso.
Immagini di microscopia confocale C rappresentante di vivono verde e morti rosso cellule 24 ore dopo idrogel culture di cellule di GBM HK sono state stabilite. Le frecce indicano le cellule con una morfologia dilagante. Le cellule sono state trasdotte con lentivirus codifica per espressione costitutiva di luciferasi firefly prima dell'incapsulamento. Tutto ritagliata immagini mostrate erano dalla macchia stessa. Generazione di dati riproducibili utilizzando questo sistema di coltura 3D richiede: Il rapporto molare dei tioli di maleimide gruppi su PEG 4-braccio dovrebbe essere sempre essere 1.
Quando peptidi sono coniugati per le maleimidi prima della formazione di gel, il numero stimato di braccia di PEG con peptidi tethered deve essere sottratto il numero totale delle maleimidi disponibili per questo calcolo. La reazione di addizione di Michael-tipo tra i gruppi tiolo e maleimide assicura che gelificazione si verifica meno di un minuto. In genere, abbiamo nuovi tirocinanti pratica diversi turni di gelificazione senza cellule prima di eseguire esperimenti di incapsulamento "reale".
Abbassamento della temperatura di reazione inserendo la piastra ben sul ghiaccio, mescolando rallenta la reazione e fornisce per maggiore tempo mescolare soluzioni precursore. Si consiglia di utilizzare pH 6, chitosani soluzione HA per consentire anche miscelazione della soluzione di gel e massimizzando la salute delle cellule.
Si consiglia di semina nell'intervallo di Estrema cura occorre prestare cambiando medium delle cellule in modo da evitare dannosi idrogel culture. In particolare, fare attenzione a non per aspirare idrogel nella pipetta. In generale, questa tecnica richiede pratica per ottenere la necessaria destrezza manuale e la coerenza.
Una volta stabilito un protocollo di specifiche di laboratorio, il sistema 3D cultura permette al ricercatore di utilizzare molti metodi di caratterizzazione come tipico per colture cellulari e tessuti espiantati. Qui, abbiamo descritto diverse tecniche per l'analisi, tra cui l'immunofluorescenza, citometria a flusso, macchiare occidentale e bioluminescenza imaging delle culture live, 3D Figura 2 Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari. You must be signed in to post a comment.
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Regolare il pH della soluzione di reazione a 5. Aggiungere 70,0 mg 0. Incubare la reazione a temperatura ambiente durante la notte mentre si mescolano. Aggiungere mg 4 x rapporto molare di ditiotreitolo DTT alla reazione. Regolare il pH torna a 8 dopo l'aggiunta del DTT e lasciare sotto agitazione per ore a temperatura ambiente. Utilizzare 1 M HCl per aggiustare il pH a 4.
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Trasferire la miscela di reazione intera in membrana di dialisi pre-impregnati cut-off di peso molecolare intorno 13 kDa e Dializzare contro DiH 2 O pre-regolata a pH 4. Il volume di DiH 2 O per dialisi deve essere almeno 40 volte il volume della soluzione HA reagito ad es. Sostituire la soluzione di dialisi DiH 2 O, pH 4 due volte al giorno per 3 giorni a temperatura ambiente.
Flash freeze soluzione dei chitosani HA in azoto liquido.
1. Introduction
Utilizzare un liofilizzatori per congelare i campioni a secco oltre 2 giorni. Mantenere la soluzione mescolando continuamente. Ci vuole almeno 1 ora per sciogliere completamente i reagenti PEG. Nel caso in cui l'aggiunta di peptidi derivati da ECM, sciogliere peptidi contenenti cisteina in PBS per preparare una soluzione di riserva.
Utilizzare una concentrazione stock di mM. Ammollo in gomma siliconica stampi in etanolo per almeno 20 min per pulirli e poi autoclave per la sterilizzazione. If you add this item to your wish list we will let you know when it becomes available.
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